軟骨肉瘤是起源于骨組織的一種惡性腫瘤,是第二大常見的骨腫瘤,且對放化療藥物均不敏感。吡咯喹啉醌( PQQ )是一種可溶于水,并且具有較好的熱穩定性小分子物質,起初被作為酶的輔因子。 PQQ 與哺乳動物的健康關系密切,可以促進機體生長、生殖,對神經、心血管系統具有很好的保護作用。
最近研究表明, PQQ 具有很好的抗腫瘤作用,對人肺腺癌、肝癌及腦癌等細胞系均具有明顯的殺傷作用,且其對正常細胞副作用較小,這使得 PQQ 可能成為腫瘤治療的理想藥物。但 PQQ 對軟骨肉瘤是否具有殺傷作用以及 PQQ 抗腫瘤的相關分子機制仍待研究。
為了明确 PQQ 是否具有特異性緻使骨腫瘤細胞系死亡作用,我們用不同濃度的 PQQ 處理體外培養的SW1353軟骨肉瘤細胞、Saos-2骨肉瘤細胞、WRL68人肝細胞、HEK293人胚腎細胞及XJH B淋巴細胞,檢測細胞死亡率。結果發現:腫瘤細胞系死亡率随着 PQQ 濃度的提高而明顯增加,當 PQQ 濃度低于120μM時,對正常細胞并無明顯毒性。結果證明 PQQ 特異性殺傷軟骨肉瘤細胞系SW1353及骨肉瘤細胞系Saos-2。
我們給予體外培養的軟骨肉瘤細胞系SW1353以 PQQ 處理,不同時間點去觀測細胞死亡率。結果發現:随着時間的增加,腫瘤細胞的死亡率也随之增加。
我們用流式細胞儀,比較分析PBS對照組及 PQQ 處理組骨腫瘤細胞系SW1353和Saos-2的凋亡水平。結果發現: PQQ 處理後,腫瘤細胞凋亡水平明顯增加。
這些結果說明 PQQ 通過引起骨腫瘤細胞凋亡來殺傷骨瘤細胞。
先前研究報道, PQQ 通過增加腫瘤氧化應激水平來促進腫瘤細胞凋亡。為了明确 PQQ 處理是否增加骨肉瘤細胞系SW1353氧化應激水平及明确相關分子機制,我們利用流式細胞儀、Western blot及生化檢測比較分析了 PBS對照組與 PQQ 處理組氧化應激水平及相關抗氧化分子的的變化,結果顯示:較PBS對照組相比, PQQ 處理組細胞活性氧(ROS)及羟自由基(OH.)水平明顯升高;還原型谷胱甘肽水平及總SOD活性明顯降低,SOD1及SOD2蛋白水平無變化。
我們利用分子對接技術分析 PQQ 與SOD1及SOD2蛋白的可能結合形式,結果發現: PQQ 可與SOD1及SOD2活性中心周圍的氨基酸結合分别形成3條及4條氫鍵,形成穩定結構,表明 PQQ 可能通過封閉SOD1及SOD2蛋白活性中心抑制酶活性。
綜上結果, PQQ 通過抑制軟骨肉瘤細胞系SW1353中SOD1及SOD2的活性,降低GSH水平以升高氧化應激,誘導細胞凋亡。
為明确 PQQ 引起軟骨肉瘤細胞系SW1353的凋亡是否通過線粒體途徑,我們利用流式細胞儀、Western blot及蛋白免疫共沉澱技術比較分析PBS對照組及 PQQ 處理組線粒體膜電勢及線粒體凋亡途徑相關分子的變化,結果顯示:較PBS對照組相比, PQQ 處理組線粒體膜電勢顯著降低;Caspase3前體水平随着 PQQ 濃度的增加而減少,并被Z-VAD所抑制;Smac與XIAP的結合顯著增加,而Caspase3與XIAP結合顯著減少;線粒中Cytochrome c水平随着 PQQ 濃度的增加而降低,細胞質中Cytochrome c水平随着 PQQ 濃度的增加而增加;線粒中AIF及EndoG的水平随着 PQQ 濃度的增加而減少,細胞核中AIF及EndoG的水平随着 PQQ 濃度的增加而增加。上述結果說明 PQQ 通過激活線粒體凋亡途徑,誘導軟骨肉瘤細胞系SW1353的凋亡。
為明确TNFα能否促進 PQQ 引起的軟骨肉瘤細胞系SW1353的凋亡,我們檢測了PBS、 PQQ 、TNFα以及 PQQ 和TNFα共同處理組細胞死亡比例、細胞形态以及凋亡水平,結果發現:較 PQQ 單獨處理組相比,TNFα與 PQQ 共同處理組腫瘤細胞死亡率顯著增加,細胞骨架破壞及細胞核濃縮更加嚴重,細胞凋亡水平明顯增加。
上述結果說明TNFα顯著促進 PQQ 引起的軟骨肉瘤細胞系SW1353的凋亡。為明确TNFα促進 PQQ 引起的軟骨肉瘤細胞系SW1353的凋亡作用是否與 PQQ 抑制TNFα引起的p65入核相關,我們利用Western blot方法檢測TNFα聯用不同濃度的 PQQ 後,p65蛋白水平變化,結果發現:胞核中p65的蛋白水平随着 PQQ 濃度的增加而逐漸增加,而胞漿中p65的蛋白水平随着 PQQ 濃度的增加而逐漸減少。這一結果說明 PQQ 抑制TNFα引起的p65入核。
為了驗證 PQQ 對TNFα引起的p65入核的抑制是否引起JNK的持續活化。我們利用In-cell Western檢測了TNFα聯用 PQQ 後,不同時間點的JNK與磷酸化JNK的水平,結果發現:TNFα單獨處理組中,當TNFα處理10分鐘後出現JNK的磷酸化,之後JNK磷酸化被抑制;而在TNFα與 PQQ 共同處理組中,JNK出現了持續的磷酸化。這一結果說明, PQQ 聯用TNFα促進了JNK的持續磷酸化。
上述結果說明, PQQ 通過抑制TNFα引起的p65入核促進細胞凋亡,至少部分是經過JNK持續磷酸化介導的。為明确 PQQ 是否能夠抑制移植瘤的生長,我們建立移植瘤模型,通過測量以及免疫組化的方法比較分析PBS對照組與 PQQ 處理組瘤體大小、瘤體體積、細胞增殖及細胞凋亡指标,結果發現:與PBS對照組相比, PQQ 處理組移植瘤體積顯著減小;細胞增殖核抗原(PCNA)陽性細胞百分比顯著降低,Tunnel染色發現凋亡細胞百分比明顯增加。
我們比較分析PBS對照組與 PQQ 處理組中移植瘤活性氧水平、DNA損傷相關指标y-H2AX以及胞核p65水平,結果發現:與PBS對照組相比, PQQ 處理組移植瘤活性氧水平明顯增加,DNA損傷相關指标γ-H2AX陽性百分比明顯增加,細胞核内p65水平降低。
上述結果說明 PQQ 通過抑制移植瘤細胞增殖及促進移植瘤細胞凋亡,而發揮抑制移植瘤生長的作用,這種作用可能通過引起移植瘤細胞氧化應激、DNA損傷增加及細胞核内p65水平降低來實現的。本研究結果證明 PQQ 可以通過抑制軟骨肉瘤細胞抗氧化系統,升高氧化應激水平,損傷線粒體以及誘導線粒體凋亡途徑誘導腫瘤細胞凋亡。此外, PQQ 還能通過抑制TNFα引起的NF-κB入核,促進JNK持續磷酸化進一步誘導細胞凋亡。此研究成果為 PQQ 以及 PQQ 與TNFα聯用治療軟骨肉瘤提供實驗與理論依據。
來源：網絡